Pietre miliari nella microscopia
Nuovo nome, nuova attrezzatura, nuovi volti
Il nuovo nome riflette l'offerta di microscopia ottica
La risorsa condivisa "Fluorescence Microscopy and Cell Imaging" (FMCI) ha cambiato nome. Dal 1° luglio, la risorsa condivisa si chiama ora "Advanced Light Microscopy" (ALM). Il cambio di nome rispecchia l'ampiezza e la portata delle tecniche e delle applicazioni di microscopia ottica offerte da questa risorsa condivisa.
La nuova tecnologia fa girare la testa
La microscopia confocale a disco rotante (SDC) offre vantaggi che la scansione laser convenzionale non offre. Utilizza lunghezze d'onda non tossiche per cellule o tessuti vivi e può fornire grandi set di dati volumetrici di sferoidi e organoidi in tempi estremamente rapidi.
Il nuovo microscopio confocale Evident Yokogawa CSU-W1 è in grado di rivelare rapidamente dati di imaging a fluorescenza a basso rapporto segnale/rumore da flussi di lavoro sperimentali complessi su campioni viventi. È dotato delle telecamere più sensibili e a più basso rumore del settore. È dotato di obiettivi a immersione in silicone i cui indici di rifrazione possono essere adattati al campione biologico. Inoltre, presenta fori distanziati per illuminare uniformemente i campioni a profondità maggiori e con maggiore velocità rispetto ai microscopi confocali convenzionali.
L'olio siliconico per immersione è formulato in modo esclusivo per corrispondere fedelmente all'indice di rifrazione del campione biologico. Questa corrispondenza precisa produce dati nitidi e puliti a profondità maggiori, grazie all'efficiente flusso di fotoni di eccitazione ed emissione tra il campione e il sensore della fotocamera.
La risorsa condivisa ALM ha dotato questo sistema di telecamere ORCA-FusionBT Hamamatsu, ovvero doppie telecamere scientifiche CMOS con tecnologia back-thinned che offrono un'efficienza quantica del 95%, frame rate a piena risoluzione (2304 x 2304 pixel) a ben 100 fotogrammi al secondo e una firma di rumore di 0.7 elettroni per pixel al secondo. Queste caratteristiche consentono ai ricercatori di catturare segnali di fluorescenza estremamente bassi su un intervallo dinamico estremamente elevato.
Nuovi volti, nuove scoperte
I nuovi progressi tecnologici nei materiali ottici e nella tecnologia dei sensori delle fotocamere hanno portato a progressi significativi nella comprensione delle attuali problematiche della biologia del cancro. E tra coloro che guidano queste nuove scoperte ci sono gli studenti del Biomedical Graduate Science Program (BGSP).
Quasi un terzo dei nuovi studenti del BGSP del 2024 ha ricevuto una formazione sulle applicazioni avanzate di microscopia ottica. La loro formazione con Michael Paffett, PhD, Direttore Tecnico della risorsa condivisa ALM, ha incluso le tecniche più innovative e le apparecchiature più moderne.
Il progetto di Myranda si concentra sulla risposta secretoria a una potente tossina batterica, EspP, secreta dalle cellule enteroemorragiche E. coliHa utilizzato i microscopi confocali Zeiss LSM800 e Olympus/Yokogawa a disco rotante per caratterizzare i cambiamenti nelle cellule enteroendocrine secretorie in seguito all'esposizione a EspP. Il suo lavoro suggerisce che il danno acuto causato da questa tossina batterica induce le cellule enteroendocrine a differenziarsi e aumenta la quantità di ormone secreto dalla mucosa come parte di una risposta immunitaria più ampia.
Cristina e 
Haydee sta lavorando insieme per studiare come l'esposizione ai metalli pesanti influenzi l'intestino. Cristina sta studiando i cambiamenti nello strato di muco secreto e nelle cellule caliciformi che producono muco e sta utilizzando il microscopio confocale a disco rotante Olympus/Yokogawa per quantificare l'altezza dello strato di muco. Ipotizza che i metalli pesanti riducano questo strato e contribuiscano all'infiammazione localizzata. Haydee sta creando organoidi umani transgenici per esaminare PROX1. Gli organoidi sono modelli tridimensionali dell'intestino umano e PROX1 è un fattore di trascrizione non canonico che potrebbe indurre l'iperplasia delle cellule secretorie in risposta all'esposizione ai metalli pesanti. Haydee utilizzerà la capacità di imaging di cellule vive del sistema Olympus/Yokogawa per definire il ruolo di PROX1 nella differenziazione e nell'iperplasia delle cellule enteroendocrine.
Lito sta studiando come l'esposizione a metalli pesanti, in particolare all'uranio non fissile, influenzi la proliferazione e la differenziazione epiteliale nell'intestino. Utilizza il microscopio confocale a disco rotante Olympus/Yokogawa per esaminare la localizzazione dei miRNA. Lito utilizza l'ibridazione in situ fluorescente RNAscope dei trascritti di biogenesi dei miRNA e di specifici miRNA. Il suo studio definirà come i miRNA regolino la differenziazione secretoria nell'intestino in seguito a danno acuto da metalli pesanti.
Il Dott. Xue ha utilizzato il sistema Leica per localizzare gli mRNA per i recettori accoppiati alle proteine G di adesione (AGPCR) in specifici tipi di cellule renali. La sua imaging dimostra per la prima volta che specifici AGPCR sono espressi in diverse cellule renali. Il suo lavoro fondamentale sui ruoli fisiologici degli AGPCR, incluso Adgrg1, prosegue con ulteriori studi che utilizzano modelli murini transgenici.
Il manoscritto del Dott. Xue, "Identificazione e localizzazione dell'espressione del recettore accoppiato alla proteina G di adesione nel rene murino", è stato recentemente pubblicato su American Journal of Physiology – Fisiologia renaleE la sua immagine RNAscope è apparsa sulla copertina di AJP Consolidated Print. L'immagine mostrava i trascritti di Adgrg1 in relazione alle cellule del tubulo prossimale/dell'arto discendente Aqp1+ e alle cellule del tubulo connettivo/principali Aqp2+.
Ryan sta studiando i recettori accoppiati alle proteine G di adesione Gpr116 e Adgrf5. I suoi studi si concentrano su come questi AGPCR influenzino la secrezione acida delle cellule intercalate di tipo A (AIC) nei dotti collettori dei reni di topo. L'ablazione di Gpr116 dai dotti collettori nei topi riduce il pH urinario consentendo l'accumulo delle pompe protoniche V-ATPasi sulla superficie delle cellule di tipo A. Ryan sta utilizzando i microscopi confocali Leica e Spinning Disc per studiare i cambiamenti morfologici nelle AIC quando secernono acido. Ipotizza che Gpr116 sia necessario per riportare la membrana delle AIC attivate al suo stato basale. Ryan sta testando la sua ipotesi su sezioni di tessuto fissate e su AIC isolate da topi reporter GFP (proteina fluorescente verde) e tdTomato.
ASCL1 e OLIG2 sono necessari per la formazione del tumore, ma regolano inversamente diversi aspetti della migrazione tumorale nel modello murino di GBM. Immagini rappresentative di tumori tdTOM+ a P30, P60 o in fase terminale nei topi di controllo (b–e), Ascl1-CKO (f–i), Olig2-CKO (j–m) e doppio CKO (n–q, s, t) (numero di tumori visualizzati: n=4/genotipo per P30 e P60 e n=6/genotipo per tumori terminali). Le frecce indicano la linea mediana e le punte di freccia indicano la distanza di migrazione delle cellule tumorali tdTOM+ sul corpo calloso (CC) controlaterale. Gli asterischi indicano la regione visualizzata per (e, i, m, q e t). ASCL1 e OLIG2 sono altamente co-espressi nelle cellule tumorali tdTOM+ di controllo, ma assenti nei tumori tdTOM+ con singolo o doppio CKO.
Parisa Nikeghbal studia come i macrofagi associati al tumore (TAM) vengono reclutati nei tumori ovarici e come influenzano la risposta di questi tumori al trattamento. Il carcinoma ovarico in stadio avanzato è caratterizzato dalla diffusione peritoneale e dall'accumulo di ascite maligna contenente sferoidi tumorali chemioresistenti e cellule immunitarie. I TAM all'interno degli sferoidi e dei tumori solidi stabiliscono una nicchia immunosoppressiva e pro-tumorigenica. Utilizzando organoidi derivati da pazienti co-coltivati con macrofagi derivati da PBMC o THP-1 umani, Parisa ha sviluppato un test di migrazione 3D per quantificare l'infiltrazione dei macrofagi utilizzando il microscopio confocale Zeiss LSM 800.