Genomica analitica e traslazionale
La risorsa condivisa di genomica analitica e traslazionale (ATG) offre servizi di sequenziamento ad alta produttività e altri servizi di genomica ai membri del Comprehensive Cancer Center dell'UNM e ad altri membri dell'UNM e delle istituzioni affiliate. I nostri servizi sono incentrati sul sequenziamento di prossima generazione, utilizzando il sequenziatore Singular Genomics G4 per generare informazioni sull'intero genoma. Questi metodi comprendono test genomici spaziali su singola cellula, RNA-seq su singola cellula, RNA-seq "in massa" regolare, sequenziamento mirato del DNA, sequenziamento dell'intero esoma, ChIP-seq e altri test. Questi test possono essere condotti utilizzando cellule vive o congelate o campioni di tessuti e archivi come FFPE.
La risorsa condivisa è finanziata dal Comprehensive Cancer Center dell'UNM attraverso la sovvenzione principale CCSG P30CA118100 e finanziamenti aggiuntivi, nonché fondi dello Stato del New Mexico e tariffe per gli utenti.
Il personale esperto è disponibile per consultazioni per assistere gli utenti nella creazione dei migliori esperimenti possibili e nell'ottimizzazione della qualità dei dati generati.
Direttore della Facoltà
Viswanathan Palanisamy, Dottorato
Professore, Medicina Interna/Medicina molecolare
Tel: (505) 272-0652
Direttore Tecnico / Bioinformatica
Kathryn (Charlie) Brayer, dottore di ricerca | CRF G22A
Staff tecnico senior
Kel Cook | CRF 118, Tel: (505) 272-5564
Magdalena (Maggie) Cifratura | CRF 119, Tel: (505) 272-5564
Olufunmilola (Funmi) Oyebamiji | CRF piano terra
Genomica analitica e traslazionale
L'ATG è accessibile a tutti i ricercatori dell'Università del New Mexico (UNM) e delle istituzioni correlate. Tuttavia, è essenziale fornire una citazione per P30CA118100 e menzionare anche ATG, insieme ad altre risorse condivise dell'UNMCCC utilizzate per produrre i dati.
Per dare credito ai nostri contributi, ti chiediamo gentilmente di includere la seguente riga nella sezione di riconoscimento dei tuoi manoscritti:
Questo studio ha ricevuto un finanziamento parziale dal Comprehensive Cancer Center Support Grant dell'UNM NCI P30CA118100 e ha utilizzato la risorsa condivisa di genomica analitica e traslazionale.
La risorsa di genomica analitica e traslazionale rimane aggiornato sugli ultimi test e tecnologie per affrontare diverse domande di ricerca. Se c'è un'applicazione che ti interessa ma che non riesci a trovare su questo sito Web, non esitare a chiedere informazioni.
L'obiettivo principale di ATG è offrire una tecnologia di sequenziamento avanzata per assistere i ricercatori nella comprensione delle condizioni biologiche. I nostri servizi includono test genomici spaziali e su singola cellula, bulk RNA-seq, sequenziamento dell'intero genoma, sequenziamento mirato del pannello genetico e test dello stato della cromatina come ChIP-seq e ATAC-seq. Offriamo anche analisi bioinformatiche esperte. La risorsa condivisa ATG è accessibile a tutti i membri della facoltà dell'UNM e delle sue istituzioni affiliate. Invitiamo vivamente gli investigatori a contattarci per esplorare come possiamo assistere nella loro ricerca e identificare i test più adatti per raggiungere i loro obiettivi.
Genomica spaziale esaminare il trascrittoma nel contesto della struttura 3D del tessuto. I test in situ 10X Visium, Visium HD e Xenium possono determinare con precisione la posizione delle trascrizioni all'interno dei tessuti e delle singole cellule. Ciò consente l'analisi dell'espressione genica riguardante le cellule vicine, facilitando una comprensione più profonda delle sottostrutture, della comunicazione intercellulare e del networking.
Saggi su singola cellula consentire ai ricercatori di valutare il trascrittoma e l'epigenetica a livello delle singole cellule. ATG utilizza la piattaforma 10x Genomics Chromium per offrire un sequenziamento di singole cellule all'avanguardia. Vari test possono essere combinati in un approccio multi-omico, consentendo l'analisi di un singolo campione in vari modi. Il materiale di partenza potrebbe essere costituito da cellule vive, nuclei isolati o campioni fissati. L'uso di campioni fissi consente l'inclusione di materiale archiviato.
Profilazione delle cellule immunitarie prevede l'analisi della diversità delle cellule immunitarie, che può essere combinata con test trascrittomici.
Genomica in massa si riferisce a progetti di sequenziamento che analizzano i campioni nel loro insieme e non richiedono l'analisi di singole cellule o informazioni spaziali. Alcuni esempi di queste tecniche sono RNA-seq, ChIP-seq, Whole Exome Sequencing (WES) e Whole Genome Sequencing (WGS).
Sequenza di lettura lunga consente ai ricercatori di esaminare l'utilizzo delle isoforme all'interno di un campione. Sebbene non disponiamo di un sequenziatore di lettura lungo, possiamo fornire una lunghezza di lettura illimitata (lunghezza massima > 4 Mb) utilizzando MinION di Nanopore Technologies.
Analisi dei dati bioinformatici: Lo staff di ATG Shared Resource utilizza tecniche avanzate di analisi dei dati per esaminare l'espressione genica e i dati di genotipizzazione. Il nostro obiettivo è offrire ai nostri utenti figure di alta qualità adatte alla pubblicazione nei loro articoli o domande di finanziamento. Al momento, utilizziamo i pacchetti software R/Bioconductor per analizzare i set di dati estesi e complessi prodotti dalle tecniche genomiche.
ATG può sequenziare i seguenti tipi:
- Rilevazione di mutazioni o varianti genetiche. Ciò potrebbe comportare la valutazione del livello di mutazioni genetiche in un tumore, l’analisi di specifiche variazioni genetiche in un particolare cancro o malattia, o la valutazione di come le cellule rispondono al danno al DNA dopo una lesione o un trattamento. In genere, ciò si ottiene utilizzando il sequenziamento mirato del pannello genetico per analizzare i geni collegati al cancro o ad alcune malattie.
- Studi di espressione genica. Profili trascrizionali di cellule, tessuti, organoidi o campioni di pazienti, sia come cellule singole che in quantità maggiori.
- Una gamma di test per l'analisi dello stato della cromatina, dagli studi sulla metilazione del DNA ai test ATAC a ChIP-seq, sono disponibili.
- Studio degli RNA non codificanti come ncRNA, lincRNA e miRNA.
Si prega di contattare Kel Cook (kelcook@salud.unm.edu) o Kathryn Brayer (kbrayer@salud.unm.edu) per programmare una consulenza.
ATG utilizza iLab per la fatturazione.
Per domande riguardanti iLab o per l'impostazione dell'account/PR per l'uso nella risorsa condivisa, inviare un'e-mail Palakshi Reddy Bandapalli o chiamare 505-272-4539.
Strumenti di genomica
Il sequenziatore G4
- Sequencer accoppiato flessibile e veloce
- In grado di produrre fino a 1.6 miliardi di letture 2 x 150 bp in 24 ore
- Può essere configurato per una varietà di lunghezze di lettura
- Compatibile con quasi tutte le librerie che possono essere sequenziate sugli strumenti Illumina.
Per maggiori informazioni: https://singulargenomics.com/g4/
Il 10x Genomics Chromium iX
- Partiziona cellule o nuclei per il sequenziamento di singole cellule
- Cattura RNA, proteine e/o cromatina
- Saggio dell'espressione genica, repertorio delle cellule immunitarie, accessibilità della cromatina, perturbazioni CRISPR
- Gli input variano a seconda del test, ma includono sospensioni di cellule vive, nuclei, cellule fissate, tessuto congelato e blocchi FFPE. Sono disponibili test indipendenti dalla specie
Per maggiori informazioni: https://www.10xgenomics.com/instruments/chromium-x-series
L'analizzatore di Xenium 10x Genomics
- Piattaforma di imaging di trascrittomica spaziale
- Risoluzione subcellulare
- Capace di catturare fino a 5,000 geni
- Pannelli genetici multipli pre-progettati che possono essere ulteriormente personalizzati (https://www.10xgenomics.com/products/xenium-panels)
Per maggiori informazioni: https://www.10xgenomics.com/platforms/xenium
Il 10x Genomics CytAssist
- Facilita i test di trascrittomica spaziale Visium e Visium HD
- Inizia da blocchi FFPE o sezioni FFPE pretagliate e appena congelate
- Compatibile con sezioni colorate con H&E o con immunofluorescenza
Per maggiori informazioni: https://www.10xgenomics.com/instruments/visium-cytassist
- Bioanalizzatore Agilent: Analizzare la qualità/quantità del DNA e dell'RNA utilizzando input minimi. (https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument)
- Fluorimetro Qubit II: Quantificazione del DNA e dell'RNA.
- Invitrogen Contessa II FL: Contare le cellule e quantificare la proporzione di cellule vive in un campione.
- Miltenyi Biotec gentle MACS Octo Dissociator con riscaldatori: Dissociare i campioni di tessuto prima del sequenziamento di singole cellule.
- Qiagen EZ2: Estrazione automatizzata di DNA e RNA.
Strumenti selezionati sono disponibili per l'uso da parte di membri qualificati e formati della comunità UNM. Gli strumenti condivisi sono disponibili durante il normale orario di lavoro e in altri orari previo accordo speciale. Si prega di contattare lo staff della struttura ATG per ulteriori informazioni sui test e sui prezzi.
Domande frequenti sull'ATG
Queste sono linee guida per i ricercatori che contemplano l'uso dei servizi di Next-Generation Sequencing (NGS) dall'ATG Shared Resource. Tutti i ricercatori sono invitati a consultare il personale ATG prima di iniziare a preparare o analizzare i campioni. Possiamo assistervi nella progettazione sperimentale e, se necessario, mettervi in contatto con esperti biostatistici che possono aiutarvi nella progettazione sperimentale. È molto importante considerare il disegno sperimentale prima di iniziare gli esperimenti NGS, che possono essere piuttosto costosi.
L'RNA-seq in massa può essere eseguito con successo con quantità minime di RNA, appena 1 ng di mRNA. ATG ne verifica l'integrità (RIN) dopo aver ricevuto gli RNA, utilizzando Agilent Bioanalyzer. Gli input suggeriti per RNA-seq sono 150 ng di RNA totale per RNA di alta qualità e 250 ng per RNA degradati (ad esempio RNA FFPE). Gli RNA vengono quindi ribodepletati per rimuovere l'rRNA indesiderato, che costituisce circa il 90% dell'RNA nelle cellule.
Gli esperimenti NGS possono essere costosi e i costi variano a seconda del test in questione. Inoltre, il costo totale dipende dal kit utilizzato per costruire le librerie e dalla profondità di sequenziamento richiesta. Contatta lo staff per avere maggiori informazioni e per avere un preventivo.
I test NGS producono set di dati estesi e complessi che contengono enormi quantità di informazioni ma possono anche essere difficili da analizzare. La risorsa condivisa ATG fornisce il primo livello di analisi, inclusa l'analisi dei parametri di controllo della qualità, l'allineamento delle letture al genoma appropriato, l'identificazione di varianti di sequenza o conteggi di caratteristiche, a seconda dei casi.
ATG Shared Resource dispone di un team di esperti di bioinformatica che eseguirà l'analisi iniziale dei dati e che gestirà ed eseguirà il backup dei dati. Possono eseguire i tipi di analisi più semplici (ad esempio l'espressione genica da RNA-seq). Un'analisi più approfondita, come la correlazione dei risultati con le informazioni del paziente, dovrebbe essere eseguita con l'input dalla risorsa condivisa di bioinformatica o dalla risorsa condivisa di biostatistica. Lo staff ATG può aiutare a stabilire interazioni con gli esperti appropriati, che dovrebbero essere coinvolti fin dall'inizio per aiutare con la progettazione sperimentale e il controllo di qualità. Si prega di discutere le vostre esigenze di analisi con i membri dello staff.
La verifica è parte integrante di ogni esperimento NGS e i requisiti variano a seconda del tipo di esperimento. Si prega di mettersi in contatto con lo staff ATG per discutere le opzioni per la verifica dei risultati NGS.
Il direttore della struttura, Viswanathan Palanisamy, Ph.D., può fornire lettere di sostegno e consigli sulla descrizione della risorsa condivisa ATG e dei potenziali esperimenti NGS nelle domande di sovvenzione. Il dottor Palanisamy ha prestato servizio in numerose sezioni di studio NIH, ACS e DOD e ha esaminato molte domande di sovvenzione, inclusi esperimenti NGS. Le sue sovvenzioni finanziate contengono esperimenti NGS. Può aiutarti a scrivere sezioni della tua sovvenzione riguardanti gli esperimenti NGS e indicare potenziali insidie e cose da evitare.
Il modo più semplice per criticare un esperimento NGS è descriverlo come una spedizione di pesca. Ecco alcune cose che dovresti assolutamente evitare.
- Non proporre di caratterizzare geni che non hai ancora identificato. Se non disponi di dati preliminari, non sai quali geni o quanti geni troverai. Tuttavia, probabilmente si conteranno a centinaia. Dire semplicemente che sceglierai alcuni geni interessanti da studiare è un modo rapido per ottenere un brutto punteggio sulla tua borsa di studio. Se possibile, il tuo esperimento dovrebbe verificare un'ipotesi. Ad esempio, potresti ipotizzare che alcuni geni (ad esempio i geni dell'apoptosi) vengano indotti. Quindi puoi proporre di utilizzare i test NGS per testarlo (e proporre la PCR in tempo reale come approccio di riserva). In questo modo puoi testare un'ipotesi, proporre risultati attesi e controlli (ad esempio i geni che dovrebbero andare su e giù), che è un modo molto migliore di fare un esperimento NGS (o qualsiasi altro esperimento). Andare semplicemente a caccia di geni è un cattivo approccio e attira sempre le ire del comitato di revisione.
- Anche semplicemente dire che utilizzerai un programma software per analizzare i dati o raggruppare i geni in percorsi ti metterà nei guai. I dati NGS possono essere estremamente complessi e richiederanno metodi statistici per l’analisi. I dati sul percorso conosciuti sono tristemente incompleti. In ogni caso, la maggior parte dei geni non si trova nei percorsi. Avrai bisogno di un approccio ben pianificato per analizzare i dati. Dovresti avere un modo per dire se l'esperimento ha funzionato o meno (ad esempio, i geni dell'apoptosi attesi sono stati attivati?).
- L'esperimento NGS non dovrebbe essere semplicemente un paragrafo alla fine di uno dei tuoi obiettivi. Qualunque cosa tu faccia, non aggiungere assolutamente un esperimento NGS alla fine di una domanda di sovvenzione come qualcosa che "farai anche tu". Gli esperimenti NGS sono grandi, costosi e complicati e non possono essere fatti come un ripensamento. Molte, molte sovvenzioni hanno una descrizione di un paragrafo di un esperimento NGS che anche i ricercatori faranno. Questo è un parafulmine per le critiche dei revisori.
- Se stai cercando i geni, dovresti cercarli per un motivo. Non proporti semplicemente di cercare geni regolati senza proporre di fare qualcosa con loro. Trovare i geni che vanno su e giù non è un obiettivo abbastanza significativo. Devi cercare i geni con uno scopo in mente (ad esempio qualche ipotesi da testare).