Genomica analitica e traslazionale

Queste sono linee guida per i ricercatori che contemplano l'uso dei servizi di Next-Generation Sequencing (NGS) dall'ATG Shared Resource. Tutti i ricercatori sono invitati a consultare il personale ATG prima di iniziare a preparare o analizzare i campioni. Possiamo assistervi nella progettazione sperimentale e, se necessario, mettervi in ​​contatto con esperti biostatistici che possono aiutarvi nella progettazione sperimentale. È molto importante considerare il disegno sperimentale prima di iniziare gli esperimenti NGS, che possono essere piuttosto costosi.

RNA-seq può essere eseguito con successo con quantità molto piccole di RNA. Tuttavia, la quantità richiesta dipende dalla "profondità di lettura" richiesta e dall'eventuale contaminazione da RNA ribosomiale. L'RNA ribosomiale è il 90% dell'RNA nelle cellule, quindi è necessario rimuovere o ridurre l'RNA ribosomiale prima di eseguire RNA-seq. I due modi per farlo sono la rimozione fisica, attraverso il "Ribodepletion", in cui le sonde biotinilate complementari agli RNA ribosomiali vengono ibridate con i campioni di RNA, quindi i complessi vengono catturati e rimossi. In alternativa, può essere utilizzato un metodo di preparazione della libreria diretto da poli-A (ad es. Smart-Seq) che eviti il ​​sequenziamento dell'RNA ribosomiale, ma che escluda altri RNA privi di code di poliA e che potrebbero essere di interesse (ad es. microRNA). Si prega di contattare lo staff delle risorse condivise di ATG per discutere le opzioni prima di iniziare gli esperimenti.

La risorsa condivisa ATG esegue un'analisi NGS a servizio completo. Tuttavia, a causa della complessità della preparazione della libreria NGS, ciò che l'ATG può fornire dipende dal tipo di esperimento. Per il sequenziamento mirato del pannello e il sequenziamento dell'esoma, abbiamo solo bisogno di campioni di DNA e produrremo le librerie, eseguiremo il sequenziamento e l'analisi iniziale. Forniremo un preventivo per il costo previsto prima di iniziare i lavori. Per RNA-seq e altri approcci, ci sono molte variazioni nel modo in cui le librerie possono essere costruite. Invitiamo gli utenti a contattare il personale ATG per discutere le opzioni prima di iniziare. Oltre al sistema completo Affymetrix, ATG Shared Resource dispone di uno spettrometro Nanodrop per la quantificazione dell'RNA in piccoli volumi e di un Agilent Bioanalyzer per analizzare rapidamente la qualità e la quantità di campioni di RNA o DNA.

Gli esperimenti NGS possono essere costosi. Il costo totale per la maggior parte degli esperimenti di grandi dimensioni (sequenziamento dell'esoma, RNA-seq, ecc.) È compreso tra $ 500 e $ 800 per campione, più un costo per la bioinformatica. Alcuni esperimenti di sequenziamento mirato più piccoli costano meno per campione. Contatta lo staff per maggiori informazioni e per richiedere un preventivo.

Sì! Gli esperimenti NGS generano set di dati grandi e complessi. L'analisi bioinformatica non è possibile senza duplicati. I tripli sono meglio. Le repliche sono davvero necessarie per ottenere buoni risultati che siano significativi e valgano il costo.

La risorsa condivisa ATG segue rigorose linee guida per il controllo della qualità e procedure operative standard per garantire che i dati siano della massima qualità e soddisfino o superino gli standard stabiliti da gruppi come il consorzio ENCODE. Utilizziamo controlli standard di picco per monitorare i processi interni ed eseguire controlli di qualità in ogni fase della produzione e del sequenziamento della libreria. Si prega di contattare il personale ATG per vedere esempi dei dati che abbiamo prodotto con successo.

La qualità dei campioni di RNA di partenza sarà confermata utilizzando Agilent BioAnalyzer o utilizzando la PCR in tempo reale. Le librerie verranno controllate in modo simile prima del sequenziamento. I controlli di punta vengono aggiunti in diverse fasi per monitorare il controllo di qualità interno.

I test NGS producono set di dati grandi e complessi che contengono enormi quantità di informazioni, ma possono anche essere difficili da analizzare. La risorsa condivisa ATG fornisce il primo livello di analisi, compresa l'analisi dei parametri di controllo della qualità, l'allineamento delle letture al genoma appropriato, l'identificazione di varianti di sequenza o conteggi delle caratteristiche, a seconda dei casi, e l'esecuzione di tipi diretti di interpretazione, come la produzione di mappe di calore per RNA-seq. Tuttavia, tipi più complicati di analisi dei dati, come la correlazione dei risultati con le informazioni sul paziente, dovrebbero essere eseguiti con il contributo di esperti della Bioinformatics Shared Resource o della Biostatistics Shared Resource. Il personale ATG può aiutare a stabilire interazioni con gli esperti appropriati, che dovrebbero essere coinvolti fin dall'inizio per aiutare con la progettazione sperimentale e il controllo di qualità.

Esiste la possibilità che il complesso processo coinvolto nella generazione dei dati NGS produca un "effetto giorno" o "effetto batch", in cui i campioni sono elaborati o analizzati sullo stesso cluster di dati insieme. Questo è un noto artefatto dell'analisi dei dati ad alta dimensionalità e includiamo controlli di picco per aiutarci a identificare e rimuovere questi tipi di problemi relativi ai dati.

L'ATG Shared Resource ha un team di esperti di bioinformatica che eseguiranno l'analisi iniziale dei dati e che gestiranno e faranno il backup dei dati. Possono eseguire i tipi più semplici di analisi (es. espressione genica da RNA-seq). Tuttavia, tipi di analisi complessi o personalizzati richiederanno il contributo di esperti aggiuntivi delle risorse condivise di biostatistica o bioinformatica. Il personale ATG può aiutare a impostare le collaborazioni necessarie.

La verifica è una parte importante di ogni esperimento NGS e i requisiti variano a seconda del tipo di esperimento. Si prega di contattare il personale ATG per discutere le opzioni per la verifica dei risultati NGS.

Il Direttore della struttura, Scott A. Ness, Ph.D., può fornire lettere di supporto e consigli su come descrivere la risorsa condivisa ATG e potenziali esperimenti NGS nelle domande di sovvenzione. Il Dr. Ness ha prestato servizio in numerose sezioni di studio NIH, ACS e DOD e ha esaminato molte domande di sovvenzione che includono esperimenti NGS. Le sue sovvenzioni finanziate contengono esperimenti NGS. Può fornire aiuto per scrivere sezioni della tua sovvenzione riguardanti gli esperimenti NGS e può indicare potenziali insidie ​​e cose da evitare.

Il modo più semplice per criticare un esperimento NGS è descriverlo come una spedizione di pesca. Ecco alcune cose che dovresti assolutamente evitare.

1. Non proporre di caratterizzare i geni che non hai ancora identificato. Se non hai dati preliminari, non sai quali geni o quanti geni troverai. Tuttavia, probabilmente saranno centinaia. Dire semplicemente che sceglierai alcuni geni interessanti da studiare è un modo rapido per ottenere un brutto punteggio sulla tua borsa di studio. Se possibile, il tuo esperimento dovrebbe verificare un'ipotesi. Ad esempio, potresti ipotizzare che alcuni geni (ad esempio i geni dell'apoptosi) vengano indotti. Quindi puoi proporre di utilizzare i test NGS per testarlo (e proporre la PCR in tempo reale come approccio di backup). In questo modo puoi testare un'ipotesi, proporre risultati attesi e controlli (ad es. geni che dovrebbero salire e scendere), che è un modo molto migliore di fare un esperimento NGS (o qualsiasi altro esperimento). Andare semplicemente a pescare i geni è un cattivo approccio e attira sempre l'ira del comitato di revisione.
2. Anche dire semplicemente che utilizzerai un programma software per analizzare i dati o raggruppare i geni in percorsi ti metterà nei guai. I dati NGS possono essere estremamente complessi e richiedono metodi statistici per l'analisi. I dati del percorso che sono noti sono tristemente incompleti. La maggior parte dei geni non si trova comunque nei percorsi. Avrai bisogno di un approccio ben pianificato per analizzare i dati. Dovresti avere un modo per dire se l'esperimento ha funzionato o meno (ad es. i geni previsti per l'apoptosi si sono attivati?).
3. L'esperimento NGS non dovrebbe essere semplicemente un paragrafo alla fine di uno dei tuoi obiettivi. Qualunque cosa tu faccia, non aggiungere assolutamente un esperimento NGS alla fine di una domanda di sovvenzione come qualcosa che "farai anche tu". Gli esperimenti NGS sono grandi, costosi e complicati e non possono essere fatti come un ripensamento. Molte, molte sovvenzioni hanno una descrizione di un paragrafo di un esperimento NGS che anche i ricercatori faranno. Questo è un parafulmine per le critiche dei revisori.
4. Se stai cercando i geni, dovresti cercarli per un motivo. Non proporti semplicemente di cercare geni regolati senza proporre di fare qualcosa con loro. Trovare i geni che vanno su e giù non è un obiettivo abbastanza significativo. Devi cercare i geni con uno scopo in mente (ad esempio qualche ipotesi da testare).