Genomica analitica e traslazionale
La risorsa condivisa di genomica analitica e traslazionale (ATG) è essenziale per il progresso della ricerca sul cancro di base, clinica e di popolazione. Offre ai membri e ai non membri dell'UNMCCC servizi di analisi genomica completi e convenienti, tra cui sequenziamento di nuova generazione (NGS), sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq), genomica spaziale, analisi iniziale dei dati e supporto per test di genomica funzionale.
e altre tecnologie legate alla genomica.
La risorsa condivisa è finanziata dal Comprehensive Cancer Center dell'UNM attraverso la sovvenzione principale CCSG P30CA118100 e finanziamenti aggiuntivi, nonché fondi dello Stato del New Mexico e tariffe per gli utenti.
Il personale esperto è disponibile per consultazioni per assistere gli utenti nella creazione dei migliori esperimenti possibili e nell'ottimizzazione della qualità dei dati generati.
Direttore della Facoltà
Viswanathan Palanisamy, Dottorato
Professore, Medicina Interna/Medicina molecolare
Tel: (505) 272-0652
Direttore Tecnico / Bioinformatica
Kathryn (Charlie) Brayer, dottore di ricerca | CRF G22A
Staff tecnico senior
Dott. Kel Cook | CRF 118, Tel: (505) 272-5564
Magdalena (Maggie) Cifratura | CRF 119, Tel: (505) 272-5564
Genomica analitica e traslazionale
L'ATG è accessibile a tutti i ricercatori dell'Università del New Mexico (UNM) e delle istituzioni collegate. Tuttavia, è essenziale fornire una citazione per P30CA118100 e menzionare anche l'ATG, insieme ad altre risorse condivise dall'UNMCCC utilizzate per produrre i dati.
Per dare credito ai nostri contributi, vi preghiamo gentilmente di includere il seguente testo nella sezione dei ringraziamenti dei vostri manoscritti:
Questo studio ha ricevuto un finanziamento parziale dal Comprehensive Cancer Center Support Grant dell'UNM NCI P30CA118100 e ha utilizzato la risorsa condivisa di genomica analitica e traslazionale.
Servizi, tecnologie e attrezzature chiave
Sequenziamento del DNA e RNA ad alto rendimento. ATG offre sequenziamento dell'intero genoma, RNA-seq in massa, ChIP-seq, RIP-seq, analisi dell'esoma e di piccoli RNA utilizzando il sequenziatore Singular Genomics G4. Il materiale di partenza può includere cellule, saliva, sangue e campioni istologici FFPE o freschi congelati.
Sequenziamento di singole cellule genomiche 10x. Utilizzando il controller Chromium 10x Genomics, insieme a un contatore cellulare automatico Countess II e a un dissociatore Miltenyi gentleMACS Octo per creare sospensioni monocellulari, il personale ATG prepara i campioni e costruisce le librerie NGS per NGS di DNA e RNA.
10x Visium-HD e Xenium in situ per l'analisi dell'intero trascrittoma e dell'espressione genica mirata. In collaborazione con la risorsa condivisa Human Tissue Repository & Tissue Analysis (HTR-TA), l'ATG offre l'analisi spaziale dell'intero trascrittoma di tessuti freschi, congelati e FFPE utilizzando le tecnologie di espressione genica spaziale in situ Visium-HD e Xenium di 10x Genomics. L'espressione genica spaziale Visium HD delinea il trascrittoma completo di intere sezioni di tessuto, fornendo contesto morfologico e alta risoluzione cellulare. Xenium in situ consente la mappatura subcellulare ad alto rendimento di un massimo di 5,000 geni insieme a proteine multiplexate all'interno dello stesso segmento di tessuto, ottenuta in collaborazione con l'HTR-TA per la preparazione dei campioni.
Analisi dei dati NGS, scRNA-seq e interazioni con le risorse condivise di biostatistica e bioinformatica e scienza dei dati (BDS). L'ATG si coordina con le Risorse Condivise di Biostatistica e BDS per definire analisi di controllo qualità e sviluppare pipeline di analisi dei dati per i dati G4-Singular, tra cui il rilevamento di varianti a singolo nucleotide (SNV) da campioni di DNA, l'analisi dell'espressione genica, l'analisi delle varianti da RNA, i dati scRNA-seq, il rilevamento di trascritti di fusione da RNA-seq e l'analisi delle varianti del numero di copie (CNV). I file elaborati vengono archiviati nel nostro account cloud AWS sicuro e utilizzati per analisi downstream dal personale dell'ATG o dal BDS, utilizzando script R personalizzati. Il Direttore Tecnico dell'ATG, Brayer, svolge il duplice ruolo di bioinformatico senior e di collegamento con le Risorse Condivise di Biostatistica e BDS per facilitare la progettazione dello studio e l'analisi dei dati.
Archiviazione ed elaborazione dati. L'ATG gestisce un account AWS sicuro, conforme all'HIPAA e approvato dall'IRB, in cui è possibile archiviare e analizzare grandi set di dati. Tutti i dati vengono anonimizzati, crittografati durante il transito e archiviati. Solo gli utenti autorizzati hanno accesso, il che richiede l'autenticazione a due fattori. Per la sicurezza dei dati genomici, l'ATG aderisce alle policy delineate nelle "Best Practice di Sicurezza per i Dati ad Accesso Controllato" del NIH, soggette alla Politica di Condivisione dei Dati Genomici del NIH.
Altri servizi. L'ATG dispone di un Agilent BioAnalyzer, un fluorimetro Qubit, un Miltenyi gentleMACs Octo Dissociator con riscaldatori (per la generazione di sospensioni monocellulari da tessuto), un contatore di cellule automatico Countess II e un ThermoFisher QuantStudio 6 Pro Q-PCR, disponibili per l'uso da parte dei membri dell'UNMCCC. È disponibile un robot di estrazione di DNA/RNA Qiagen EZ2 per l'estrazione automatizzata di acidi nucleici ad alto volume.
ATG può sequenziare i seguenti tipi:
- Rilevazione di mutazioni o varianti genetiche. Ciò potrebbe comportare la valutazione del livello di mutazioni genetiche in un tumore, l’analisi di specifiche variazioni genetiche in un particolare cancro o malattia, o la valutazione di come le cellule rispondono al danno al DNA dopo una lesione o un trattamento. In genere, ciò si ottiene utilizzando il sequenziamento mirato del pannello genetico per analizzare i geni collegati al cancro o ad alcune malattie.
- Studi di espressione genica. Profili trascrizionali di cellule, tessuti, organoidi o campioni di pazienti, sia come cellule singole che in quantità maggiori.
- Una gamma di test per l'analisi dello stato della cromatina, dagli studi sulla metilazione del DNA ai test ATAC a ChIP-seq, sono disponibili.
- Studio degli RNA non codificanti come ncRNA, lincRNA, miRNA e tRNA.
Si prega di contattare Kel Cook (kelcook@salud.unm.edu) o Kathryn Brayer (kbrayer@salud.unm.edu) per programmare una consulenza.
ATG utilizza iLab per la fatturazione.
Per domande riguardanti iLab o per l'impostazione dell'account/PR per l'uso nella risorsa condivisa, inviare un'e-mail Palakshi Reddy Bandapalli o chiamare 505-272-4539.
Strumenti di genomica
Il sequenziatore G4 di Singular Genomics
- Sequencer accoppiato flessibile e veloce
- In grado di produrre fino a 1.6 miliardi di letture 2 x 150 bp in 24 ore
- Può essere configurato per una varietà di lunghezze di lettura
- Compatibile con quasi tutte le librerie che possono essere sequenziate sugli strumenti Illumina.
Per maggiori informazioni: https://www.singulargenomics.com/
Il 10x Genomics Chromium iX
- Partiziona cellule o nuclei per il sequenziamento di singole cellule
- Cattura RNA, proteine e/o cromatina
- Saggio dell'espressione genica, repertorio delle cellule immunitarie, accessibilità della cromatina, perturbazioni CRISPR
- Gli input variano a seconda del test, ma includono sospensioni di cellule vive, nuclei, cellule fissate, tessuto congelato e blocchi FFPE. Sono disponibili test indipendenti dalla specie
Per maggiori informazioni: https://www.10xgenomics.com/instruments/chromium-x-series
L'analizzatore di Xenium 10x Genomics
- Piattaforma di imaging di trascrittomica spaziale
- Risoluzione subcellulare
- Capace di catturare fino a 5,000 geni
- Pannelli genetici multipli pre-progettati che possono essere ulteriormente personalizzati (https://www.10xgenomics.com/products/xenium-panels)
Per maggiori informazioni: https://www.10xgenomics.com/platforms/xenium
Il 10x Genomics CytAssist
- Facilita i test di trascrittomica spaziale Visium e Visium HD
- Inizia da blocchi FFPE o sezioni FFPE pretagliate e appena congelate
- Compatibile con sezioni colorate con H&E o con immunofluorescenza
Per maggiori informazioni: https://www.10xgenomics.com/instruments/visium-cytassist
- Bioanalizzatore Agilent: Analizzare la qualità/quantità del DNA e dell'RNA utilizzando input minimi. (https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument)
- Fluorimetro Qubit II: Quantificazione del DNA e dell'RNA.
- ThermoFisher/Invitrogen Countess II: Contare le cellule e quantificare la proporzione di cellule vive in un campione.
- Miltenyi Biotec gentle MACS Octo Dissociator con riscaldatori: Dissociare i campioni di tessuto prima del sequenziamento di singole cellule.
- Qiagen EZ2: Estrazione automatizzata di DNA e RNA.
- ThermoFisher QuantStudio 6 Pro Q-PCR. Sistema PCR in tempo reale con blocchi da 96 e 384 pozzetti per consentire flessibilità e semplicità nelle analisi dell'espressione genica.
Strumenti selezionati sono disponibili per l'uso da parte di membri qualificati e formati della comunità UNM. Gli strumenti condivisi sono disponibili durante il normale orario di lavoro e in altri orari previo accordo speciale. Si prega di contattare lo staff della struttura ATG per ulteriori informazioni sui test e sui prezzi.
Domande frequenti sull'ATG
Queste sono linee guida per i ricercatori che contemplano l'uso dei servizi di Next-Generation Sequencing (NGS) dall'ATG Shared Resource. Tutti i ricercatori sono invitati a consultare il personale ATG prima di iniziare a preparare o analizzare i campioni. Possiamo assistervi nella progettazione sperimentale e, se necessario, mettervi in contatto con esperti biostatistici che possono aiutarvi nella progettazione sperimentale. È molto importante considerare il disegno sperimentale prima di iniziare gli esperimenti NGS, che possono essere piuttosto costosi.
L'RNA-seq in massa può essere eseguito con successo con quantità minime di RNA, appena 1 ng di mRNA. ATG ne verifica l'integrità (RIN) dopo aver ricevuto gli RNA, utilizzando Agilent Bioanalyzer. Gli input suggeriti per RNA-seq sono 150 ng di RNA totale per RNA di alta qualità e 250 ng per RNA degradati (ad esempio RNA FFPE). Gli RNA vengono quindi ribodepletati per rimuovere l'rRNA indesiderato, che costituisce circa il 90% dell'RNA nelle cellule.
Gli esperimenti NGS possono essere costosi e i costi variano a seconda del test in questione. Inoltre, il costo totale dipende dal kit utilizzato per costruire le librerie e dalla profondità di sequenziamento richiesta. Contatta lo staff per avere maggiori informazioni e per avere un preventivo.
I test NGS producono set di dati estesi e complessi che contengono enormi quantità di informazioni ma possono anche essere difficili da analizzare. La risorsa condivisa ATG fornisce il primo livello di analisi, inclusa l'analisi dei parametri di controllo della qualità, l'allineamento delle letture al genoma appropriato, l'identificazione di varianti di sequenza o conteggi di caratteristiche, a seconda dei casi.
ATG Shared Resource dispone di un team di esperti di bioinformatica che eseguirà l'analisi iniziale dei dati e che gestirà ed eseguirà il backup dei dati. Possono eseguire i tipi di analisi più semplici (ad esempio l'espressione genica da RNA-seq). Un'analisi più approfondita, come la correlazione dei risultati con le informazioni del paziente, dovrebbe essere eseguita con l'input dalla risorsa condivisa di bioinformatica o dalla risorsa condivisa di biostatistica. Lo staff ATG può aiutare a stabilire interazioni con gli esperti appropriati, che dovrebbero essere coinvolti fin dall'inizio per aiutare con la progettazione sperimentale e il controllo di qualità. Si prega di discutere le vostre esigenze di analisi con i membri dello staff.
La verifica è parte integrante di ogni esperimento NGS e i requisiti variano a seconda del tipo di esperimento. Si prega di mettersi in contatto con lo staff ATG per discutere le opzioni per la verifica dei risultati NGS.
Il direttore della struttura, Viswanathan Palanisamy, Ph.D., può fornire lettere di sostegno e consigli sulla descrizione della risorsa condivisa ATG e dei potenziali esperimenti NGS nelle domande di sovvenzione. Il dottor Palanisamy ha prestato servizio in numerose sezioni di studio NIH, ACS e DOD e ha esaminato molte domande di sovvenzione, inclusi esperimenti NGS. Le sue sovvenzioni finanziate contengono esperimenti NGS. Può aiutarti a scrivere sezioni della tua sovvenzione riguardanti gli esperimenti NGS e indicare potenziali insidie e cose da evitare.
Il modo più semplice per criticare un esperimento NGS è descriverlo come una spedizione di pesca. Ecco alcune cose che dovresti assolutamente evitare.
- Non proporre di caratterizzare geni che non hai ancora identificato. Se non disponi di dati preliminari, non sai quali geni o quanti geni troverai. Tuttavia, probabilmente si conteranno a centinaia. Dire semplicemente che sceglierai alcuni geni interessanti da studiare è un modo rapido per ottenere un brutto punteggio sulla tua borsa di studio. Se possibile, il tuo esperimento dovrebbe verificare un'ipotesi. Ad esempio, potresti ipotizzare che alcuni geni (ad esempio i geni dell'apoptosi) vengano indotti. Quindi puoi proporre di utilizzare i test NGS per testarlo (e proporre la PCR in tempo reale come approccio di riserva). In questo modo puoi testare un'ipotesi, proporre risultati attesi e controlli (ad esempio i geni che dovrebbero andare su e giù), che è un modo molto migliore di fare un esperimento NGS (o qualsiasi altro esperimento). Andare semplicemente a caccia di geni è un cattivo approccio e attira sempre le ire del comitato di revisione.
- Anche semplicemente dire che utilizzerai un programma software per analizzare i dati o raggruppare i geni in percorsi ti metterà nei guai. I dati NGS possono essere estremamente complessi e richiederanno metodi statistici per l’analisi. I dati sul percorso conosciuti sono tristemente incompleti. In ogni caso, la maggior parte dei geni non si trova nei percorsi. Avrai bisogno di un approccio ben pianificato per analizzare i dati. Dovresti avere un modo per dire se l'esperimento ha funzionato o meno (ad esempio, i geni dell'apoptosi attesi sono stati attivati?).
- L'esperimento NGS non dovrebbe essere semplicemente un paragrafo alla fine di uno dei tuoi obiettivi. Qualunque cosa tu faccia, non aggiungere assolutamente un esperimento NGS alla fine di una domanda di sovvenzione come qualcosa che "farai anche tu". Gli esperimenti NGS sono grandi, costosi e complicati e non possono essere fatti come un ripensamento. Molte, molte sovvenzioni hanno una descrizione di un paragrafo di un esperimento NGS che anche i ricercatori faranno. Questo è un parafulmine per le critiche dei revisori.
- Se stai cercando i geni, dovresti cercarli per un motivo. Non proporti semplicemente di cercare geni regolati senza proporre di fare qualcosa con loro. Trovare i geni che vanno su e giù non è un obiettivo abbastanza significativo. Devi cercare i geni con uno scopo in mente (ad esempio qualche ipotesi da testare).